Tạo dòng đột biến đồng thời họ gen eIF4e thông qua hệ thống CRISPR/ Cas9 nâng cao tính kháng virus PVY trên cây thuốc lá

08/03/2021
Đây là nghiên cứu đầu tiên trên thế giới ứng dụng thành công hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để tạo đột biến đồng thời họ gen eIF4e trên cây thuốc lá K326. Các dòng thuốc lá mang gen đột biến trong nghiên cứu này, đặc biệt dòng mang đột biến đồng thời họ gen eIF4e giúp bảo hộ cây khỏi virus PVY một cách ổn định qua các thế hệ mà không ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây.

Thuốc lá là cây trồng có giá trị kinh tế cao, cũng được xem là cây mô hình cho nhiều nghiên cứu trên thực vật. Tuy nhiên, thuốc lá cũng là đối tượng cây trồng chịu ảnh hưởng nghiêm trọng của các loại sâu bệnh hại phổ biến, trong đó có các bênh do virus gây ra. PVY (Potato virus Y) là một trong những loài virus nguy hiểm nhất ở thực vật, đặc biệt với các cây họ cà. Sử dụng giống kháng bệnh được xem là biện pháp hiệu quả nhất đang được áp dụng trong quản lý và kiểm soát bệnh do virus PVY gây ra.

Sau 02 năm thực hiện đề tài cấp cơ sở Viện Công nghệ sinh học, đề tài “Phát triển hệ thống CRISPR/ Cas9 để tạo dòng đột biến đồng thời họ gen eIF4e nhằm nâng cao tính kháng virus PVY trên cây thuốc lá” mã số CS19-18 và “Đánh giá tính kháng virus PVY của các dòng thuốc lá mang đột biến đồng thời họ gen eIF4e tạo được bằng công nghệ CRISPR/Cas9”  mã số CS20-10 do TS. Đỗ Tiến Phát, Viện Công nghệ sinh học thực hiện đã nghiệm thu với kết quả xuất sắc, tạo ra các dòng thuốc lá mang gen đột biến, đặc biệt dòng mang đột biến đồng thời họ gen eIF4e giúp bảo hộ cây khỏi virus PVY một cách ổn định qua các thế hệ mà không ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây.

Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học đã sử dụng hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để gây đột biến đồng thời họ gen eIF4e nhằm nâng cao tính kháng virus PVY trên cây thuốc lá giống K326. Vector chuyển gen mang hệ thống CRISPR/Cas9 chứa đồng thời 2 trình tự định hướng gRNAs nhằm tạo đột biến đồng thời cả 4 gen eIF4E1-S, eIF4E1-T, eIF4E2-S và eIF4E2-T thuộc họ gen eIF4E ở thuốc lá được thiết kế thành công và chuyển vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Kết quả chuyển gen đã thu được 26 dòng T0 mang đột biến, xác định được một số dòng thuốc lá T0 mang đột biến đồng thời 4 gen eIF4E1-S, eIF4E1-T, eIF4E2-S và eIF4E2-T. Sáu dòng đột biến điển hình được phân tích bằng phương pháp giải trình tự (Hình 1,2).

Hình 1. Xác định các dòng thuốc lá đột biến thông qua phương pháp biến tính hồi tính và đi di trên gel polyacrynamide. Các băng vạch DNA sai khác so với mẫu đối chứng (WT) khẳng định sự có mặt của đột biến trên các gen quan tâm
Hình 2. Kết quả phân tích dạng đột biến trên các gen eIF4E1-S (A), eIF4E1-T (B), eIF4E2-S (C) và eIF4E2-T (D) của các dòng thuốc lá T0 bằng phương pháp giải trình tự. (phần tô xanh là điểm PAM, phần tô vàng là trình tự định hướng)

Để kiểm tra ảnh hưởng của các đột biến tới tính kháng virus PVY, các nhà khoa học đã tiến hành thu thập, định danh và tạo nguồn lây nhiễm virus PVY cho các dòng thuốc lá mang gen đột biến. Kết quả phân tích cho thấy, các cây mang đột biến đồng thời 4 gen thuộc họ gen eIF4e  cho tính kháng lâu dài và bền vững với virus PVY mà không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây, ít nhất với chủng PVY0 (chủng virus PVY phổ biến nhất trên thế giới) đã được sử dụng để khảo nghiệm (Hình 3,4).

Hình 3. Kết quả định lượng DAS – ELISA sau 2-3-4 tuần lây nhiễm virus PVY.
WT: cây thuốc lá không mang đột biến; còn lại là các dòng thuốc lá đột biến gen; Tính kháng hoan toàn được ghi nhận ở dùng eF-10 mang đột biến mất chức năng của cả 4 gen thuộc họ eIF4E
Hình 4. Tính kháng virus PVY của các dòng thuốc lá đột biến eIF-10. Dòng thuốc lá đột biến mất chức năng cả 4 gen thuộc họ eIF4E; WT. Cây thuốc lá đối chứng không mang đột biến.

Việc tạo cây thuốc lá mang gen kháng virus PVY có ý nghĩa quan trọng trong cải thiện giống chống lại bệnh hại, tăng năng suất cây trồng, nâng cao hiệu quả kinh tế. Từ kết quả nghiên cứu của đề tài, các nhà khoa học tiếp tục đánh giá tính kháng với các loại virus nguy hiểm khác gây hại trên cây thuốc lá; cũng là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về nâng cao tính kháng virus trên các cây trồng khác và mở rộng tiềm năng cải tạo giống kháng bệnh.

 

Nguồn tin: TS. Đỗ Tiến Phát, Viện Công nghệ sinh học
Xử lý tin: Thanh Hà


Tags:
Tin liên quan