Nghiên cứu sự đa hình phân tử và khả năng thể hiện hoạt tính Cytotoxin và một số hoạt tính sinh học khác của Ribonuclease từ nọc rắn hổ mang Việt Nam
Trong mấy thập kỉ gần đây hướng nghiên cứu về các hoạt tính sinh học mới của nhóm enzyme RNase nói chung, siêu họ RNase nói riêng, được tiến hành cả theo chiều rộng và chiều sâu, từ các nghiên cứu tìm kiếm các RNase mới trong tự nhiên có các tính chất sinh học mới (1), đến các nghiên cứu tạo ra các biến thể RNase tái tổ hợp có hoạt tính cytotoxin (2). Các hướng nghiên cứu này đã mang lại những kết quả hứa hẹn về khả năng sử dụng các enzyme thuộc nhóm RNase làm dược phẩm thế hệ mới để chữa bệnh. Nhiệm vụ Hợp tác quốc tế với Quỹ NCCB Nga, mã số VAST.HTQT.NGA.07/15-16, do PGS.TS. Nguyễn văn Thiết ở Viện Công nghệ sinh học là chủ nhiệm, đã được tiến hành theo hướng thứ nhất, phía đối tác nước ngoài là Viện Hóa sinh hữu cơ mang tên các viện sỹ Shemyakin & Ovchinnikov.
Trong nhiệm vụ Hợp tác quốc tế này, RNase nọc rắn được chọn làm đối tượng nghiên cứu vì nọc rắn là nguồn rất giàu các chất có hoạt tính sinh học cao. Nọc rắn là dịch cơ thể có hoạt tính RNase cao nhất. Tuy nhiên, RNase nọc rắn vẫn là enzyme chưa được nghiên cứu nhiều, không chỉ so với các enzyme thuộc nhóm RNase, mà cả so với các enzyme khác trong nọc rắn. Có lẽ đây chính là nguyên nhân vì sao mà hiện nay vai trò của RNase trong tác động độc chung của nọc rắn vẫn còn chưa rõ. Mục tiêu của nhiệm vụ HTQT này là nghiên cứu một số tính chất sinh học của RNase từ nọc rắn hổ mang (Naja atra) của Việt Nam nhằm: (1) Tìm hiểu vai trò của enzyme này trong tác động độc chung của nọc rắn; và (2) Đánh giá khả năng thể hiện hoạt tính gây độc tế bào (hoạt tính cytotoxin) và một số hoạt tính sinh học khác (như hoạt tính kháng khuẩn, chống virus…) của RNase trong nọc rắn, nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác và sử dụng một cách hiệu quả nguồn dược liệu cổ truyền quý này phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
Các kết quả chính của nhiệm vụ:
Một trong các kết quả chính của nhiệm vụ là đã xác định được sự đa hình phân tử cao của RNase nọc rắn hổ mang Việt Nam (bảng 1). Bằng kĩ thuật sắc kí (sắc kí sàng lọc phân tử [hay sắc kí lọc gel], sắc kí trao đổi ion và HPLC pha ngược), đã xác định được một số nguyên nhân dẫn tới sự đa hình phân tử cao này: các dạng/isoform của RNase nọc rắn có thể khác nhau về (i) khối lượng phân tử (MW); (ii) điện tích bề mặt; (iii) tính kị nước, và (iv) tổ hợp của các yếu tố này. Nhờ kết hợp sắc kí trên các cột trao đổi cation với HPLC trên các cột khác nhau, đã nhận được nhiều isoform RNase có độ sạch cao, trong số đó có 4 isoform đạt mức tinh khiết hoặc gần như tinh khiết. Đã xác định được MW của một số dạng/isoform của RNase nọc rắn hổ mang Việt Nam (bảng 2) bằng các phương pháp sắc kí lọc gel (hình 1), điện di (hình 2) và khối phổ (hình 3). Các phân tích cấu trúc đã xác định được sự tương đồng của 2 isoform Р4-20 và Р3-21 với Phsspholipase A2 (PLA2) nọc rắn, và sự tương đồng của 4 isoform Р6-27, Р4-31, Р4-34 và Р3-36 với neurotoxin II (NT II) ngắn và các toxin ba ngón (Three-Finged Toxins, TFT) khác (bảng 3).
Bảng 1. Tổng hợp kết quả nghiên cứu đa hình phân tử của RNase nọc rắn hổ mang Việt Nam
Hình 1. Sắc kí đồ nọc rắn nhận được trên cột lọc gel
Hình 2. Ảnh điện di của 6 isoform khác nhau về thời gian lưu cột (đường 2-7). Đường 1 là Neurotoxin II; đường 8 là các protein-marker
Hình 3. MALDI mass-spectra của 4 isoform RNase tinh sạch từ nọc rắn hổ mang Việt Nam Naja atra
Bảng 2. Tổng hợp kết quả xác định MW của các dạng RNase bằng các phương pháp khác nhau
Bảng 3. Mức dộ tương đồng của các isoform của RNase với PLA2 và các toxin của nọc rắn
Kết quả xác định MW và phân tích cấu trúc cho phép kết luận rằng dạng RNase II và các isoform P4-20 & P3-21 với MW 12-14 kDa thuộc loại RNase ngoại tiết kinh điển có mặt trong tất cả các loại nọc rắn, và giả định rằng các dạng với MW thấp: RNase III (MW ~ 8-9 kDa), RNase IV (MW ~ 6 kDa) và các isoform của chúng là có bản chất là toxin. Xuất phát từ giả thiết về bản chất toxin của RNase nọc rắn hổ mang mà chúng tôi đã lần đầu tiên phát hiện được rằng neurotoxin II (NT II) và một số toxin thuộc nhóm toxin ba ngón có hoạt tính RNase (hình 4).
Hình 4. Ảnh điện di sản phẩm thủy phân RNA bởi NT II (đường 2, 3) và các chế phẩm RNase khác (các đường 4-9); đường 12-13: đối chứng dương (RNase A),
đường 1 & 10: đối chứng âm (RNA)
Về kết quả nghiên cứu các hoạt tính sinh học của enzyme, đã phát hiện được: 1) isoform RNase P4-34 có hoạt tính cytotoxin đối với các dòng tế bào ung thư PC12, Neuro2a và mcf7; 2) các isoform RNase P6-27. P4-31 và P3-36 có hoạt tính phân hóa tế bào ung thư dòng PC12 thành các tế bào giống tế bào thần kinh.
Đã công bố 02 bài báo quốc tế (01 bài tiếng Nga trên Tạp chí Actualscience 2016, Том 2, No 1 (6), c. 5-6., 01 bài tiếng Anh trên Tạp chí Journal of Animal Science and Technology (2017) 59:20. DOI 10.1186/s40781-017-0145-5), 01 bài trên tạp chí quốc gia (Tạp chí Dược liệu, số 1+2/2016, tr. 111-116), 01 báo cáo tại hội nghị quốc gia (Báo cáo KH Hội nghị toàn quốc Hệ thống bảo tàng thiên nhiên VN. 3/2016. tr. 631-639) và 01 báo tại hội tháo quốc tế VAST-RFBR (Proceedings of Scientific workshop VAST-RFBR, Hanoi, February 2016, p.371-379). Ngoài ra còn 01 bài đã gửi Tạp chí Доклады Aкадемии наук.
Ngoài các kết quả trình bày trên đây, phía đối tác có văn bản đề nghị hợp tác nghiên cứu tiếp các vấn đề khoa học nảy sinh từ các kết quả mới của nhiệm vụ Hợp tác quốc tế này.
Nhiệm vụ đã được hội đồng nghiệm thu cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (tháng 11/2017) đánh giá đạt loại xuất sắc.
Nguồn: PGS.TS. Nguyễn Văn Thiết, Viện Công nghệ sinh học
Xử lý tin: Mai Lan
