Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh Virus Corona gây bệnh viêm phổi cấp (SARS-CoV-2) ở bệnh nhân Việt Nam bằng kỹ thuật Realtime PCR
Dịch bệnh viêm đường hô hấp COVID-19 do virus SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome corona virus 2) gây ra, được phát hiện đầu tiên vào tháng 12/2019 tại Vũ Hán, Trung Quốc và hiện là đại dịch toàn cầu với mức độ lây nhiễm rất cao. SARS-CoV-2 là virus thuộc bộ Nidovirales, họ Coronaviridae, chi Sarbecovirus, là virus RNA sợi dương không phân mảnh, kích thước ~ 30 kb, chứa ít nhất 6 khung đọc mở (open reading frame, ORF) mã hóa cho các protein của virus, bao gồm ARN polymerase phụ thuộc ARN (RNA-dependent ARN polymerase, RdRP), protein gai S (spike), protein vỏ virus E (envelope), protein màng M (membrane), protein nhân N (nucleocapsid) và các protein phụ khác mà virus sử dụng để lây nhiễm các tế bào (Hình 1).
 |
| Hình 1. Đặc điểm cấu trúc bộ gen virus SARS-CoV-2 (B) sắp xếp theo trình tự 5′-leader-UTR- replicase-S (Spike) -E (Envelope) -M (Membrane) - N (Nucleocapsid) -3 UTR-poly (A) với các gen bổ trợ xen kẽ trong các gen cấu trúc ở đầu 3’ của bộ gen. (Nguồn Chen và Zhong, 2020) |
Với diễn biến phức tạp của dịch bệnh COVID-19, ngay khi dịch mới khởi phát Chủ tịch Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giao cho Viện Công nghệ sinh học nhiệm vụ “Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh virus Corona gây bệnh viêm phổi cấp (SARS-CoV-2) ở bệnh nhân Việt Nam bằng kỹ thuật Realtime PCR”, mã số: CT0000.04/20-20 do PGS.TS. Đồng Văn Quyền làm chủ nhiệm với mục tiêu tạo được bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh, nhạy và đặc hiệu virus SARS-CoV-2, góp phần vào việc khống chế dịch bệnh tại Việt Nam. Đề tài được thực hiện trong thời gian 10 tháng, từ tháng 2/2020 đến tháng 12/2020.
Tại thời điểm nghiên cứu, dữ liệu thông tin về hệ gen SARS-CoV-2 trên thế giới cũng như tại Việt Nam còn rất ít. Để phát triển bộ sinh phẩm (Kit), nhóm nghiên cứu đã nhận được vật liệu di truyền là mẫu RNA tách chiết từ virus SARS-CoV-2 gây bệnh cho bệnh nhân Việt Nam do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp; các mẫu RNA của các virus gây bệnh đường hô hấp ở người do bệnh viện Trung ương Quân đội 108 và Viện Y học Dự phòng Quân đội cung cấp để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ Kit.
Bộ Kit được phát triển dựa trên công nghệ Realtime RT-PCR trên cơ sở các cặp mồi và mẫu dò được nhóm nghiên cứu thiết kế và chỉnh lý dựa trên trình tự các gen/vùng gen quan trọng của virus SARS-CoV-2 được phân lập tại Việt Nam mà nhóm nghiên cứu đã tách dòng và giải trình tự (Hình 2) và hàng trăm trình tự của virus SARS-CoV-2 đã được các nước công bố trên ngân hàng gen quốc tế. Trên thế giới lúc đó một số nước đã phát triển được bộ kit xét nghiệm SARS-CoV-2 sử dụng trên công nghệ realtime RT-PCR, như bộ Kit được WHO khuyến cáo dựa trên việc phát hiện hai vùng gen đích (Gen E và RdRp), bộ Kit của CDC Mỹ hướng đến ba vùng gen đích (N1, N2 và N3), bộ Kit của Đức hướng đến ba vùng gen đích (N, E và RdRp). Qua phân tích dựa trên dữ liệu trình tự hệ gen của chủng SARS-CoV-2 lưu hành tại Việt Nam và trên thế giới, nhóm nghiên cứu đã phát triển bộ Kit dựa trên 2 vùng gen đích là gen N và ORF1ab.
Về kết quả, nhiệm vụ đã giải trình tự và đăng ký 5 trình tự gen mã hóa protein S, M, E, N, RdRp và vùng ORF1ab của SARS-CoV-2 trên ngân hàng gen quốc tế với các mã số MT127116, MT127115, MT127114, MT127113 và MT712208. Kết quả giải trình tự đã cung cấp thông tin giá trị cho việc phát triển kit chẩn đoán. Đồng thời các gen này được tách dòng để làm chứng dương cho bộ Kit.
Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các đoạn gen từ SARS-CoV-2 phân lập tại Việt Nam
Hình 3. Bộ kit chẩn đoán nhanh virus Corona gây bệnh viêm phổi cấp (SARS-CoV-2) bằng kỹ thuật realtime PCR
Sau khi phát triển thành công, bộ Kit chẩn đoán virus SARS-CoV-2 đã được đánh giá thử nghiệm tại Viện Công nghệ sinh học và được đánh giá ngoại kiểm bởi Viện Y học dự phòng quân đội, Bộ Quốc phòng. Kết quả đánh giá cho thấy bộ Kit có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương với bộ Kit realtime RT-PCR do Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyến cáo cũng như bộ Kit thương mại dùng trong chẩn đoán SARS-CoV-2 với các thông số kỹ thuật: độ đặc hiệu lâm sàng là 100% (17/17), độ nhạy lâm sàng là 100% (10/10), ngưỡng phát hiện 50 phản copy/phản ứng, ổn định sau 6 tháng bảo quản ở -20oC.
Kết quả nghiên cứu tạo bộ Kit được đánh giá bởi Hội đồng khoa học của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng sự tham gia các chuyên gia từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế - Bộ Y tế.
Hình 4. Biểu đồ biểu diễn ngưỡng phát hiện (A) với gen N và (B) với gen ORF1ab
 |
| Hình 5. Kết quả phát hiện SARS-CoV-2 trên bệnh phẩm lâm sàng thực hiện trên hệ thiết bị Realtime PCR DTprime (DNA Technology, Nga) tại Viện Y học dự phòng Quân đội |
Bên cạnh đó, nhiệm vụ cũng đã công bố 01 bài báo trên Tạp chí Sinh học số 43(2) DOI: 10.15625/2615-9023/15846; Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cho bộ kit Realtime RT-PCR phát hiện SARS-CoV-2, mã TCCS 01:2020/VCNSH theo Quyết định số 253/QĐ-CNSH ký ngày 07/4/2020 của Viện Công nghệ sinh học và đào tạo 01 học viên cao học tại cơ sở đào tạo Đại học Dược Hà Nội. Ngày 05/04/2021, nhiệm vụ đã được Hội đồng nghiệm thu cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam họp và đánh giá xếp loại Khá.
Kết quả nghiên cứu của đề tài khẳng định Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã làm chủ công nghệ hiện đại và hoàn toàn chủ động trong việc tạo bộ Kit realtime RT-PCR để phát hiện virus SARS-CoV-2 tại Việt Nam.
