Nghiên cứu khai thác các trình tự FN3 và Ig trong cấu trúc module cellulase của vi khuẩn trong dạ cỏ dê

12/05/2022
Cùng với sự phát triển của ngành nông nghiệp với qui mô sản xuất ngày càng lớn và tập trung ở nước ta như hiện nay, các phụ phẩm nông nghiệp mà trong đó nguồn sinh khối lignocellulose chiếm phần lớn đang chủ yếu bị đốt bỏ gây lãng phí và ảnh hưởng xấu đến môi trường. Trong khi đó, nhân loại đang phải đối mặt với tình trạng suy kiệt nguồn nguyên liệu hóa thạch cũng như hệ quả nghiêm trọng của việc tích tụ khí thải nhà kính. Việc nghiên cứu sử dụng nguồn năng lượng carbonhydrate từ nguyên liệu có khả năng tái tạo với trữ lượng khổng lồ như lignocellulose là hết sức cấp thiết để tạo ra các sản phẩm thay thế các nhiên liệu được sản xuất từ nguyên liệu hóa thạch.

Lignocellulose nói chung hay cellulose nói riêng là sinh khối có cấu trúc vững chắc, được chuyển hóa theo nhiều bước để tạo thành sản phẩm cuối cùng mà trong đó giai đoạn đường hóa đóng vai trò then chốt. Trong quá trình này, cellulase được xác định là nhân tố chính quyết định tới hiệu suất chuyển hóa và giá thành của sản phẩm. Do vậy, trong những năm gần đây trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu tìm kiếm nguồn cellulase mới có hoạt tính cao, có ái lực mạnh với cơ chất để chuyển hóa hiệu quả cellulose. Khác với enzyme khác, phần lớn các cellulase có cấu trúc module, có nghĩa là ngoài vùng có chức năng xúc tác, enzyme còn chứa thêm một số module khác có cấu trúc độc lập và ít được nghiên cứu, điển hình như module FN3, Ig, CBM. Hiện nay trên thế giới, nghiên cứu về vai trò của các module chưa biết chức năng đến hoạt tính xúc tác của cellulase chưa được công bố nhiều. Nhiều giả thiết cho rằng, chúng không chỉ tồn tại như một vùng nối giữa các module khác nhau trong cấu trúc bậc 3 của enzyme mà chúng còn thể hiện nhiều chức năng sinh học quan trọng khác như ổn định cấu trúc, làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất. Vì vậy, nghiên cứu làm rõ vai trò sinh học của các module này trong cấu trúc của cellulase là hết sức có ý nghĩa cho việc lựa chọn hoặc thiết kế các enzyme để nâng cao hiệu quả thủy phân nguồn sinh khối cellulose.

Từ năm 2014 đến năm 2017, bằng nguồn kinh phí của Đề tài độc lập cấp Nhà nước (Mã số: ĐTĐLCN.15/14) do TS. Phùng Thu Nguyệt làm chủ nhiệm, phòng Kỹ thuật di truyền (Viện Công nghệ sinh học, Viện HLKHCNVN) đã giải mã DNA đa hệ gen của hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê chăn thả tự nhiên trên núi tại tỉnh Ninh Bình và Thanh Hóa. Kết quả, từ 8,6 Gb dữ liệu trình tự, đề tài đã khai thác được 816 trình tự mã hóa cho cellulase. Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học đã nhìn thấy nhiều module đặc trưng của cellulase trong dạ cỏ dê, trong đó điển hình là FN3 và Ig. 

Từ năm 2018-2020, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học tiếp tục thực hiện đề tài “Nghiên cứu vai trò của vùng chưa biết chức năng trong cấu trúc module của cellulase”, mã số VAST02.05/18-19, với mục đích đánh giá đa dạng cấu trúc module của cellulase trong dạ cỏ dê và làm sáng tỏ vai trò của FN3 lên cấu trúc và chức năng của enzyme cellulase. Đề tài do PGS.TS Đỗ Thị Huyền làm chủ nhiệm. 

Kết quả của đề tài đã cho thấy số lượng các cellulase có chứa module FN3 và Ig chiếm tỷ lệ rất lớn. Từ 297 trình tự ORF hoàn thiện mã hóa cho cellulase, dựa trên kết quả phân tích domain bằng Pfam, 148 trình tự cellulase chứa các modules FN3, Ig đã được xác định. Hầu hết FN3 xuất hiện sau vùng domain hoạt tính ở 90,9% beta-glucosidase GH3, tất cả Ig thì ở vùng trước domain hoạt tính endoglucanase GH9 (Hình 1). Từ dữ liệu các nhà khoa học đã khai thác được 1 trình tư có FN3 nằm sau vùng X và trước domain xúc tác của endoglucanase GH5 (Hình 1). Đây là cấu trúc hiếm gặp. Vì vậy để nghiên cứu được vai trò của các vùng X, FN3 lên endoglucanase GH5 này nhóm nghiên cứu đã tiến hành tạo enzyme hoàn thiện và các vùng riêng rẽ ở dạng tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli. Theo đó, toàn bộ enzyme (XFN3GH5) và các tiểu phần FN3, XFN3, FN3GH5, GH5 đã được biểu hiện trong tế bào E. coli sử dụng vector biểu hiện pET22b(+) và pET22SUMO. Trong vector pET22b(+) các protein được biểu hiện dưới dạng đơn, không dụng hợp. Trong vector pET22SUMO, các protein sau khi biểu hiện được dung hợp với vùng Small Ubiqutin Modifier (SUMO viết tắt là S trong cấu trúc enzyme biểu hiện) nên các protein sau biểu hiện sẽ có tên là SFN3, SXFN3, SEG5, SFN3EG5, SXFN3EG5. Vùng SUMO có vai trò giúp hình thành cấu trúc bậc 3 của enzyme hoàn thiện hơn đặc biệt đối với các protein có cầu disulfit. Sau đó, các cấu trúc protein được tinh chế bằng cột sắc ký ái lực để thu được protein sạch dùng cho nghiên cứu tính chất. Kết của cho thấy FN3 và SFN3 làm tăng khả năng tan của GH5 trong cấu trúc FN3GH5, SFN3GH5. SFN3 giúp định hình cấu trúc của GH5 trong SFN3GH5 làm tăng sự tương tác của module và ái lực của enzyme với cơ chất tan để làm tăng hoạt tính của SXFN3GH5, SFN3GH5 trong dung dịch. Cả hai cấu trúc SFN3 và SXFN3 không có khả năng neo giữ enzyme trên giấy lọc nhưng làm bong tróc bề mặt giấy lọc, nới lỏng cấu trúc cellulose giúp cho enzyme thủy phân giấy (Hình 1B). Nghiên cứu này giúp các nhà khoa học và các nhà thiết kế có thể chọn lựa nhanh những cấu trúc enzyme có khả năng tan tốt, dễ biểu hiện ở dạng tái tổ hợp dựa trên trình tự amino acid để có thể ứng dụng vào thực tiễn.


Hình 1.Cấu trúc của 148 cellulase có domain FN3, Ig được khai thác từ dữ liệu DNA metagenome của vi khuẩn trong dạ cỏ dê (A)

và SFN3, SXFN3 làm bong tróc bề mặt giấy lọc, nới lỏng cấu trúc cellulose trên bề mặt giấy lọc (B)

“Đây là công trình lần đầu tiên chứng minh FN3 có vai trò giúp tăng tính tan của protein, giúp enzyme hình thành cấu trúc đúng và giúp nới lỏng vùng cellulose tinh thể. Kết quả của nghiên cứu sẽ giúp các nhà di truyền học, các nhà thiết kế định hướng lựa chọn cấu trúc enzyme để sản xuất enzyme tái tổ hợp”, PGS.TS. Đỗ Thị Huyền cho biết. 

Ngày 25/01/2021, đề tài “Nghiên cứu vai trò của vùng chưa biết chức năng trong cấu trúc module của cellulase” được Hội đồng nghiệm thu cấp Viện Hàn lâm KHCNVN đánh giá xếp loại xuất sắc. 

 

Nguồn tin: PGS.TS. Đỗ Thị Huyền – Viện Công nghệ sinh học
Xử lý tin: Minh Tâm 



Tags:
Tin liên quan