Chẩn đoán phân tử: Sự phát triển và Ứng dụng trong nghiên cứu

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................ 15
LỜI NÓI ĐẦU....................................................................................... 19
GIỚI THIỆU CHUNG ......................................................................... 21
1. Lịch sử hình thành chẩn đoán phân tử........................................... 21
2. Từ cách mạng PCR đến kỷ nguyên hậu di truyền......................... 24
3. Triển vọng phát triển chẩn đoán phân tử trên thế giới và Việt Nam...................................................................................... 31
4. Tiêu chuẩn phòng thí nghiệm chẩn đoán phân tử ......................... 37
4.1. Phòng thí nghiệm chẩn đoán phân tử .......................................... 37
4.2. Quy chuẩn quốc tế....................................................................... 39
4.3. Kiểm định và chứng nhận tiêu chuẩn.......................................... 42
4.4. Các yếu tố chất lượng trong hệ thống quản lý ............................ 43
4.5. Quản lý chất lượng...................................................................... 45
4.6. Đánh giá chất lượng .................................................................... 46
4.7. Giá trị trong chẩn đoán điều trị ................................................... 47
4.8. Nâng cao chất lượng chẩn đoán .................................................. 48
5. An toàn phòng khám và phòng thí nghiệm .................................... 49
5.1. Một số quy định và các vấn đề an toàn liên quan ....................... 49
5.2. Huấn luyện và đào tạo an toàn trong phòng khám hay phòng
thí nghiệm .......................................................................................... 50
5.3. Đánh giá và quản lý nguy cơ....................................................... 50
5.4. Nguy cơ từ các nguồn lây nhiễm vi sinh vật............................... 52
5.4.1. Lây nhiễm vi sinh vật........................................................... 53
5.4.2. An toàn sinh học trong phòng thí nghiệm vi sinh................ 55
5.5. Nguy cơ từ các nguồn hóa chất ................................................... 56
5.5.1. Một số nguyên tắc sử dụng hóa chất trong phòng thí nghiệm............................................................................. 58
5.5.2. Cách quản lý hóa chất trong phòng thí nghiệm .................. 59
5.5.3. An toàn cháy nổ................................................................... 59
5.5.4. An toàn điện......................................................................... 63
PHẦN 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ
Chương 1. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT NUCLETIC ACID (DNA - RNA) ........................................................ 65
1.1. Mẫu tách chiết DNA ................................................................... 66
1.2. Phương pháp tách chiết DNA ..................................................... 68
1.2.1. Phương pháp hữu cơ (Phenol-chloroform) ......................... 68
1.2.2. Phương pháp vô cơ (Salting-out) ........................................ 71
1.2.3. Phương pháp tách chiết chelex ........................................... 72
1.2.4. Phương pháp tách chiết trên pha rắn.................................. 73
1.2.5. Phương pháp tách chiết vi phân.......................................... 75
1.3. Phương pháp tách chiết DNA ty thể ........................................... 76
1.4. Phương pháp tách chiết RNA...................................................... 77
1.4.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số ................................. 77
1.4.2. Phương pháp tách chiết RNA thông tin............................... 79
1.5. Phương pháp định lượng và định tính nucleic acid..................... 80
1.5.1. Điện di ................................................................................. 80
1.5.2. Định lượng nucleic acid ...................................................... 91
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ..................................... 94
2.1. Southern blot ............................................................................... 95
2.2. Northern blot ............................................................................. 103
2.3. Dot (slot) blot ............................................................................ 104
2.4. Microarray ................................................................................. 106
2.5. Lai tại chỗ.................................................................................. 108
2.5.1. Chu kỳ tế bào..................................................................... 109
2.5.2. Nhiễm sắc thể .................................................................... 110
2.6. Lai huỳnh quang tại chỗ............................................................ 116
2.6.1. Phương pháp FISH nhanh................................................. 117
2.6.2. Phương pháp FISH trên các cụm kỳ giữa ......................... 122
Chương 3. PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH ĐẠI NUCLEIC ACID .... 127
3.1. Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) và các phương pháp cải tiến .... 127
3.1.1. Quy trình thực hiện PCR ................................................... 128
3.1.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................... 130
3.2. Các phương pháp PCR cải tiến ................................................. 130
3.2.1. PCR định lượng................................................................. 131
3.2.2. PCR đa mồi........................................................................ 134
3.2.3. PCR phiên mã ngược......................................................... 135
3.2.4. PCR lồng ........................................................................... 137
3.2.5. Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn ................................. 138
3.2.6. Real-time PCR và đầu dò huỳnh quang ............................ 139
Chương 4. PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN ..................... 149
4.1. Giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học............................ 149
4.2. Giải trình tự gen bằng phương pháp enzyme ............................ 151
4.3. Giải trình tự gen thế hệ mới ...................................................... 153
4.3.1. Lịch sử phát triển giải trình tự gen thế hệ mới.................. 154
4.3.2. Giải trình tự thế hệ thứ nhất.............................................. 154
4.3.3. Giải trình tự thế hệ thứ hai................................................ 156
4.3.4. Giải trình tự thế hệ thứ ba................................................. 164
4.3.5. Giải trình tự thế hệ thứ tư - Giải trình tự tức thời dựa trên tín hiệu điện phân tử.................................................................... 165
Chương 5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PROTEIN ................... 168
5.1. Điện di SDS-PAGE ................................................................... 168
5.1.1. Nguyên lý........................................................................... 169
5.1.2. Quy trình điện di................................................................ 170
5.1.3. Xác định khối lượng phân tử ............................................. 176
5.1.4. Các ứng dụng .................................................................... 177
5.2. Điện di 2 chiều .......................................................................... 178
5.2.1. Nguyên lý........................................................................... 178
5.2.2. Phát hiện protein ............................................................... 181
5.2.3. Phần mềm phân tích điện di 2 chiều ................................. 181
5.3. Sắc ký lỏng nano đa chiều......................................................... 183
5.4. Khối phổ - Trung tâm của proteomics ...................................... 184
5.4.1. Nguyên lý của khối phổ ..................................................... 184
5.4.2. Hoạt động và cấu tạo chung của máy khối phổ ................ 184
5.5. Phương pháp MALDI-TOF....................................................... 185
5.6. Phương pháp ESI-MS/MS......................................................... 186
5.7. Sắc ký khí ghép khối phổ.......................................................... 188
5.7.1. Nguyên lý........................................................................... 188
5.7.2. Phân tích GC/MS............................................................... 190
5.7.3. Một số ứng dụng của phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ................................................................................................... 193
5.8. Các phần mềm tin sinh học trong phân tích.............................. 193
5.9. Các cơ sở dữ liệu về trình tự gen và protein ............................. 194
PHẦN 2. ỨNG DỤNG CỦA CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ
Chương 6. ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU PHÁP Y.................................................................. 197
6.1. Giới thiệu chung........................................................................ 197
6.1.1. Lịch sử về xác định danh tính con người trước khi biết đến phân tử DNA................................................................................ 198
6.1.2. Xét nghiệm DNA: Sự phát triển và những ưu điểm........... 199
6.2. Những dấu hiệu di truyền chung cho nghiên cứu pháp y.......... 201
6.2.1. Các marker lặp lại ngắn.................................................... 202
6.2.2. Các marker nhiễm sắc thể Y.............................................. 207
6.2.3. Các marker DNA ty thể ..................................................... 209
6.2.4. Các marker đa hình nucleotide đơn .................................. 212
6.3. Các phương pháp chẩn đoán phân tử sử dụng trong nghiên cứu pháp y............................................................................ 213
6.3.1. Real-time PCR định lượng ................................................ 213
6.3.2. Kit PCR định lượng thương mại........................................ 216
6.3.3. Điện di mao quản .............................................................. 217
6.3.4. Giải trình tự gen thế hệ mới trong nghiên cứu pháp y ...... 218
Chương 7. ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ TRONG HỆ GEN DƯỢC HỌC VÀ PHÁT TRIỂN THUỐC MỚI ..................... 223
7.1. Hệ gen dược học - Phân biệt giữa gen dược học và hệ gen
dược học........................................................................................... 223
7.2. Phương pháp phân tích trong hệ gen dược học......................... 226
7.3. Hệ gen dược học trong chẩn đoán lâm sàng ............................. 227
7.3.1. CYP2C9/VKORC1 và warfarin ......................................... 22712
7.3.2. TPMT và 6-Mercilaurine ................................................... 229
7.3.3. CYP2D6 và tamoxifen ....................................................... 230
7.3.4. UGT1A1 và irinotecan ...................................................... 232
7.3.5. HLA*B5710 và abacavir ................................................... 234
7.4. Những khác biệt về quần thể trong hệ gen dược học................ 235
7.5. Các kiểu hình phức tạp.............................................................. 239
7.6. Hệ gen dược học và cơ quan quản lý ........................................ 241
7.7. Hệ gen dược học trong phát triển thuốc.................................... 242
7.8. Nguồn tài liệu hữu ích trong hệ gen dược học .......................... 245
7.9. Xu hướng mới trong nghiên cứu hệ gen dược học......................... 248
Chương 8. ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU CÁC BỆNH DI TRUYỀN VÀ UNG THƯ ............ 252
8.1. Bệnh di truyền và cơ chế gây ung thư....................................... 252
8.2. Chẩn đoán phân tử phát hiện đột biến....................................... 254
8.3. Ứng dụng phương pháp chẩn đoán phân tử bệnh di truyền ...... 255
8.3.1. Bất thường nhiễm sắc thể .................................................. 255
8.3.2. Chẩn đoán phân tử các bệnh do rối loạn đơn gen ............ 257
8.3.3. Rối loạn đơn gen không theo quy luật di truyền ............... 260
8.4. Ứng dụng chẩn đoán phân tử phát hiện ung thư ....................... 263
8.4.1. Phương pháp sinh thiết lỏng ............................................. 263
8.4.2. Giải trình tự vùng mã hóa ................................................. 265
8.4.3. Một số đột biến gây ung thư và phương pháp phát hiện... 265
Chương 9. PHÁT HIỆN CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH (VI KHUẨN, VIRUS, NẤM, KÝ SINH TRÙNG) .................................. 272
9.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm.......................................................... 272
9.2. Chuẩn bị mẫu ............................................................................ 274
9.3. Chất lượng đối chứng................................................................ 276
9.4. Các xét nghiệm phân tử phát hiện các tác nhân vi khuẩn gây bệnh....................................................................................... 278
9.4.1. Lựa chọn trình tự đích để phát hiện tác nhân vi khuẩn gây bệnh...................................................................................... 278
9.4.2. Phương pháp phân tử phát hiện vi khuẩn ......................... 281
9.4.3. Các tác nhân gây bệnh đường hô hấp............................... 283
9.4.4. Các tác nhân gây bệnh đường tiết niệu sinh dục .............. 284
9.4.5. Các chất kháng khuẩn ....................................................... 286
9.4.6. Khả năng đề kháng với các chất kháng khuẩn.................. 287
9.4.7. Chẩn đoán phân tử sự đề kháng với các chất kháng khuẩn.. 290
9.5. Các xét nghiệm phân tử phát hiện các tác nhân virus gây bệnh.... 293
9.6. Các xét nghiệm phân tử phát hiện các tác nhân nấm gây bệnh..... 301
9.7. Các xét nghiệm phân tử phát hiện các tác nhân ký sinh trùng gây bệnh.............................................................................. 302
Chương 10. XÉT NGHIỆM TIỀN SINH KHÔNG XÂM LẤN ..... 304
10.1. Lịch sử của xét nghiệm tiền sinh không xâm lấn......................... 304
10.1.1. Tế bào thai nhi trong máu mẹ.......................................... 304
10.1.2. DNA thai nhi tự do trong máu mẹ ................................... 305
10.1.3. RNA thai nhi tự do trong máu mẹ.................................... 307
10.1.4. Các vùng methyl hoá khác nhau giữa mẹ và thai nhi...... 307
10.1.5. Nguồn gốc của DNA thai nhi tự do ................................. 307
10.2. Thiết lập sàng lọc và chẩn đoán tiền sinh ............................... 308
10.2.1. Sàng lọc ........................................................................... 308
10.2.2. Chẩn đoán ....................................................................... 309
10.2.3. Sự nguy hiểm của xét nghiệm xâm lấn ............................ 310
10.3. Các phương pháp xét nghiệm tiền sinh không xâm lấn .......... 310
10.3.1. Giải trình tự toàn bộ hệ gen ............................................ 311
10.3.2. Giải trình tự đích dựa trên đa hình đơn nucleotide ........ 312
10.3.3. Phương pháp làm giàu bắt mục tiêu ............................... 314
10.3.4. Phương pháp dựa trên microarray ................................. 315
10.4. Các yếu tố sinh học và kỹ thuật ảnh hưởng đến kết quả xét
nghiệm tiền sinh không xâm lấn ...................................................... 316
10.4.1. Thành phần base guanine cytosine của nhiễm sắc thể.... 317
10.4.2. Giá trị nhiễm sắc thể ....................................................... 317
10.4.3. Sự khác nhau số lượng bản sao mẹ ................................. 318
10.4.4. Sàng lọc dị bội thể đối với thai đôi.................................. 318
10.4.5. Kết quả dương tính giả và âm tính giả............................ 319
10.5. Ứng dụng của xét nghiệm tiền sinh không xâm lấn .............. 320
10.6. Vấn đề tư vấn và đạo đức........................................................ 321
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................. 323