Thông tin Đề tài

Tên đề tài Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên S1 oligomer tái tổ hợp của Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)-gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana
Mã số đề tài VAST02.02/18-19
Cơ quan chủ trì (Cơ quan thực hiện) Viện Công nghệ Sinh học
Thuộc Danh mục đề tài Hướng Công nghệ sinh học (VAST02)
Họ và tên TS. Vũ Huyền Trang
Thời gian thực hiện 01/01/2018 - 31/12/2020
Tổng kinh phí 600 triệu đồng
Xếp loại Xuất sắc
Mục tiêu đề tài

Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên S1 oligomer tái tổ hợp của Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)-gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana định hướng tạo vacxin thế hệ mới
Các mục tiêu cụ thể bao gồm:
- Thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa tiểu phần S1 của kháng nguyên Spike
- Biểu hiện và tinh sạch được các kháng nguyên S1 của Spike
- Chứng minh được kháng nguyên tinh sạch S1 tái tổ hợp có khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên chuột.

 

Kết quả chính của đề tài

Về khoa học:
- Đã thiết kế thành công 04 cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên S1/COE gắn GCN4pII; 04 cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên S1/COE gắn GCN4pII-tp; 04 cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên S1/COE gắn GCN4pII-Stag; 01 vector biểu hiện mang gen mã hóa S protein và tạo 13 chủng A. tumefaciens mang các vector tương ứng.
- Đã biểu hiện được các kháng nguyên S1 và COE tái tổ hợp trên cây thuốc lá và lựa chọn được các điều kiện tối ưu cho sự biểu hiện của các protein COE trimer và COE oligomer.
- Đã tối ưu được quy trình tinh sạch được protein COE bằng phương pháp sắc ký ái lực. Các protein COE  trimer, COE-oligomer Stag và COE oligomer tp sau khi tinh sạch đều có độ tinh sạch trên 95% với hàm lượng đạt tương ứng là 2,08 mg, 0,59 mg và 0,85 mg.
- Đánh giá được hoạt tính sinh miễn dịch của các protein COE trên chuột và lợn. Dịch chiết thô chứa protein COE-G1a trimer có khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV và kháng thể trung hòa PEDV tương đương với vaccine thương mại trên chuột. Protein COE-G2a trimer tinh sạch có khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV và kháng thể trung hòa ở cả lợn mẹ được tiêm và lợn con bú mẹ.

Về ứng dụng:
Kháng nguyên COE-G1a trimer từ thực vật có tính sinh miễn dịch trên chuột tương đương với một vaccine thương mại. Kháng nguyên COE-G2a trimer từ thực vật đã kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV và kháng thể trung hòa PEDV trên lợn. Kháng nguyên COE-G2a trimer từ thực vật là một ứng viên tiềm năng trong phát triển sản xuất vacxin chống lại PEDV.

Hình 1. Xác định sự biểu hiện của protein COE-GCN4pII trong thực vật. (A)  Sơ đồ cassette biểu hiện của COE trong thực vật (B) Xác định sự biểu hiện của protein COE-GCN4pII trong cây thuốc lá Nicotiana benthamiana  bằng Western blot. (C) Phân tích kết quả tinh sạch protein COE-GCN4pII bằng điện di SDS-PAGE và Western blot (D).

Hình 2. Xác định trạng thái oligomer hóa của protein COE-GCN4pII
(A) Phát hiện trạng thái oligomer hóa của protein COE-GCN4pII thông qua phản ứng liên kết chéo. (B) COE-GCN4pII protein được phân tách trong điều kiện điện di không biến tính (Native PAGE) và phát hiện bằngWestern blot (C).

Hình 3. Đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu PEDV trên chuột
 G1: nhóm chuột đối chứng âm được tiêm lá cây thuốc lá không chuyển gen; G2: nhóm chuột đối chứng dương được vaccine thương mại; G3: nhóm chuột được tiêm COE-GCN4pII

Hình 4. Kết quả đánh giá khả năng sản sinh kháng thể trung hòa ở nhóm chuột được tiêm kháng nguyên bằng phản ứng trung hòa virus trên tế bào
(A) Hình ảnh bệnh tích tế bào được ghi nhận bằng kính hiển vi quang học; (B) Hiệu giá kháng thể trung hòa ở các nhóm chuột được tiêm. p<0,05: sai khác có ý nghĩa thống kê.

Những đóng góp mới

Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về biểu hiện và tinh sạch protein kháng nguyên S1/COE của PEDV từ thực vật bằng phương pháp agroinfiltration. Đồng thời kháng nguyên COE trimer đã kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV và kháng thể trung hòa PEDV trên chuột và trên lợn. Đề tài mở ra hướng nghiên cứu mới sản xuất vaccine hiệu quả cao chống lại PEDV.

Sản phẩm đề tài

- Các bài báo đã công bố: 02 bài báo đã công bố trên Tạp chí quốc tế và Tạp chí quốc gia

  • Ho TT, Nguyen GT, Pham NB, Le VP, Trinh TBN, Vu TH, Phan HT, Conrad U, Chu HH (2020). Plant-Derived Trimeric CO-26K-Equivalent Epitope Induced Neutralizing Antibodies Against Porcine Epidemic Diarrhea Virus. Frontiers in Immunology, 11. doi:10.3389/fimmu.2020.02152.
  • Hồ Thị Thương, Lê Thu Ngọc, Nguyễn Thu Giang, Trịnh Thái Vy, Phan Trọng Hoàng, Phạm Bích Ngọc, Vũ Huyền Trang, Hoàng Thị Thu Hằng, Chu Hoàng Hà. Nghiên cứu sự biểu hiện của kháng nguyên S1 tái tổ hợp của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (Porcine epidemic diarrhea virus) trong cây thuốc lá Nicotiana benthamiana. Tạp chí Công nghệ sinh học (Chấp nhận đăng).

- Các sản phẩm cụ thể:

  • Gen S1 tổng hợp nhân tạo mã hóa dựa trên trình tự gen S1 của chủng PEDV đang gây bệnh ở Việt Nam
  • 04 cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa S1/COE gắn GCN4pII; 04 cấu trúc biểu hiện mang gen mã hóa S1/COE gắn GCN4pII-tp; 04 cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa S1/COE gắn Stag; 01 cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa S protein-tp và 13 chủng Agrobacterium mang các vector tương ứng
  • 2,08 mg protein COE G2a trimer tinh sạch; 0,59 mg protein COE-oligomer Stag tinh sạch và 0,85 mg protein COE oligomer tp tinh sạch
  • Quy trình tạo kháng nguyên COE/S1 tái tái tổ hợp

- Các sản phẩm đào tạo: hỗ trợ đào tạo 01 nghiên cứu sinh

Kiến nghị

- Đánh giá khả năng bảo hộ trên lợn con được sinh ra từ lợn mẹ được tiêm protein COE-G2a trimer tinh sạch
- Đánh giá tính sinh miễn dịch và khả năng bảo hộ của protein COE-G2a oligomer tp tinh sạch trên lợn mẹ và lợn con
- Xây dựng và hoàn thiện quy trình để bào chế vaccine phòng chống PEDV từ các protein COE tái tổ hợp từ thực vật

Ảnh nổi bật đề tài
1624413600322-82.4.jpg